肺癌
肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一。按其组织学分类一般可分为以下4种：鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌。其中以鳞癌最为常见，约占全部肺癌例数的30%～50%。在我国尤其是在大、中城市，肺鳞癌的发病率近数十年来成倍增长，临床统计已占肺癌总数的50%～70%[1]。目前在肺癌发病的分子机制方面，已从基因和转录水平进行了许多成功的研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白质来实现，若能直接从蛋白质整体水平入手来研究肺癌，将能更加全面、真实地揭示肺癌的癌变过程。随着对蛋白质组分析技术的出现及在肺癌研究中的应用，已识别鉴定出一些肿瘤标志物并用于临床诊断，但是肺鳞癌蛋白质组研究突显不足，因此有必要对在我国发病率高的肺鳞癌开展蛋白质组研究。
本实验室先前的研究已应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离了人肺鳞癌组织及相应的癌旁正常支气管上皮组织的总蛋白质，并对其差异蛋白质点进行了鉴定，得到了一些有意义的结果。由于炎性假瘤在临床上与肺癌极易混淆，因而本研究拟建立人肺鳞癌组织及肺炎性假瘤的双向凝胶电泳图谱，再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI?TOF?MS)及数据库搜索对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定，以期为人肺鳞癌与炎性假瘤的早期鉴别诊断、治疗以及新药开发等提供线索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织标本 7例人肺鳞癌组织及7例炎性假瘤取自中南大学湘雅一医院、湘雅二医院的手术切除标本，并经病理诊断确诊。
1.1.2 试剂 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品;硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、双向凝胶电泳标准蛋白质、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲—酮—胰蛋白酶(TPCK?Trypsin)、铁氰化钾[K3Fe(CN)6]、三氟乙酸(TFA)、基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)、氯化钙(CaCl2)均为Sigma公司产品;固相pH梯度干胶条(IPG strip pH 3～10L，24cm)、IPG缓冲液(pH 3～10L)、两性电解质(pharmalyte，pH 3～10)、覆盖液、低分子量标准蛋白质、蛋白银染试剂盒、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均为Amershan Pharmacia公司产品;甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、DNA酶、RNA酶均为Promega公司产品;硫代硫酸钠(Na2S2O3)、碳酸氢铵(NH4HCO3)为国产分析纯;乙腈为国产色谱纯。
1.1.3 仪器 IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT twelve system、ImageMaste 2D Elite 4.01凝胶图像分析软件、Imagescanner扫描仪、Labscan扫描控制和分析前处理软件(Pharmacia公司产品);SaVant冷冻浓缩机(美国);Applied Biosystem Voyager?DETM STR BiospectrometryTM workstation System 4307 MALDI?TOF?MS质谱仪(ABI公司);Elx800自动酶标仪(Bio?Tek Instrumets，Inc)。
1.2 方法
1.2.1 组织标本的处理 取术后新鲜的肺癌组织及肺炎性假瘤组织，无菌状态下将组织分别用生理盐水反复清洗，以去除血液，并尽可能剪去多余的其他组织。处理后的样品立即用于蛋白质的抽提或置于-80℃保存。
1.2.2 组织总蛋白质的制备 30～80mg组织样品于液氮下充分研磨至粉末状，置于400ml裂解液(7mol/L urea，2mol/L thiourea，2% NP-40，1% Triton X-100，100mmol/L DTT，5mmol/L PMSF，4% CHAPS，0.5mmol/L EDTA，40mmol/L Tris，2% pharmalyte，1mg/ml DNaseⅠ，0.25mg/ml RNase A)中，充分旋涡混匀，置于37℃孵育箱孵育1h，取出后再充分旋涡，4℃，15000r/min离心30min[2]，吸取上清液即为组织的总蛋白质，用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质的浓度。
1.2.3 固相pH梯度双向凝胶电泳 (1)第一向固相pH梯度等电聚焦:IPG?DALT主要按以往的方法进行[2]。将已定量总体积为450ml的组织总蛋白质抽提物与水化液加入24cm IPG持胶槽，放置好IPG干胶条，pH 3～10L(240mm×3mm×0.5mm)后，于IPG phor等电聚焦仪上水化和聚焦在20℃自动进行，总电压时间积为69920Vh，其中于30V低电压水化14h，然后经过500V 1h、1000V 1h，最后稳定在8000V下进行等电聚焦。(2)平衡:等电聚焦结束后，迅速取出一向的IPG胶条先后置于10ml平衡液A(50mmol/L Tris?HCL pH 6.8，6mol/L urea，30%甘油，1% SDS，0.2% DTT)和10ml平衡液B(50mmol/L Tris?HCL pH 6.8，6mol/L urea，30%甘油，1%SDS，3%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)中分别平衡15min。(3)第二向垂直板SDS?PAGE电泳:将平衡后的胶条移至1mm厚的12.5%均匀分离胶的上端，用0.5%琼脂糖封胶，15℃循环水冷却，先设置恒功率2.5W/块胶进行电泳30min，再改用恒功率17W/块胶进行电泳，当溴酚蓝离胶最底端约5mm处停止电泳。